改良简易法获取人退变椎间盘髓核细胞及生物学特点

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (28): 5139-5144.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.007

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改良简易法获取人退变椎间盘髓核细胞及生物学特点

王海，黄博，周跃，王建，李长青

解放军第三军医大学新桥医院骨科，重庆市 400037

出版日期:2013-07-09 发布日期:2013-07-09
通讯作者: 周跃，博士，教授，主任医师，解放军第三军医大学新桥医院骨科，重庆市 400037 happyzhou@vip.163.com
作者简介:王海，男，1981年生，湖南省耒阳市人，汉族，解放军第三军医大学在读硕士，主要从事脊柱外科的基础与临床研究。 awangling@163.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81101364； 81071498)

Biological characteristics of nucleus pulposus cells from human degenerative intervertebral disc using the improved simple method

Wang Hai, Huang Bo, Zhou Yue, Wang Jian, Li Chang-qing

Department of Orthopedics, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of PLA, Chongqing 400037, China

Online:2013-07-09 Published:2013-07-09
Contact: Zhou Yue, M.D., Professor, Chief physician, Department of Orthopedics, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of PLA, Chongqing 400037, China happyzhou@vip.163.com
About author:Wang Hai, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of PLA, Chongqing 400037, China awangling@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81101364*, 81071498*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前较常应用的原代髓核细胞培养方法，多应用Ⅱ型胶原酶联合胰酶消化法、单纯Ⅱ型胶原酶消化法等，但这些方法获取细胞数量偏少存在一定的缺限。

目的：利用改良简易传统的方法从人退变椎间盘获取髓核细胞。

方法：分离培养髓核细胞，每日倒置相差显微镜下观察髓核细胞形态，取原代和传代细胞培养悬液进行锥虫蓝细胞活性检测，分别于第1，3，5，7，9，11，13天采用MTT法测细胞生长情况，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞形态。

结果与结论：成功分离出髓核细胞，成功传至P3代。原代细胞生长为梭形，P1及P2传代细胞形态多呈三角形或多角形，类似成纤维细胞形态，接近融合时呈铺路石样外观。锥虫蓝染色细胞活力测定原代分离时活力为99%，第3代细胞活力稍下降为93%-95%。髓核细胞随着传代的次数的增加，增殖活性逐渐降低，P2代和P3代在对数生长期相对P1代也逐渐趋于平缓。激光共聚焦显微镜观察细胞形态与相差显微镜观察的结果相似。结果提示，改良简易法相对于传统方法能可靠地获取人退变椎间盘多种细胞且所获细胞表现出了良好的生物学性能。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 髓核细胞, 改良简易法, 椎间盘, 腰椎间盘突出症, 细胞培养, 细胞增殖, 形态学, 生物学性能, Ⅱ型胶原酶, 细胞生长曲线, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The commonly used culture methods for primary intervertebral disc cells are type Ⅱ collagenase alone digestion method, and type Ⅱ collagenase combined trypin digestion method. However, the acquired cells are few.

OBJECTIVE: To acquire nucleus pulposus cells from human degenerative intervertebral disc using a systemic and simplified method.

METHODS: Nucleus pulposus cells were isolated and cultured. The morphology of nucleus pulposus cells was observed under inverted phase contrast microscope every day. Primary and subcultured cell suspension was applied for the determination of cell viability using trypan blue staining. The cell growth was detected with MTT assay. The cell morphology was observed under laser confocal microscopy.

RESULTS AND CONCLUSION: Nucleus pulposus cells were successfully isolated from from human degenerative intervertebral disc using the improved method, and cells were subcultured to passage 3. Primary cells were fusiform shaped, while cells at passage 1 and 2 were triangle or polygonal, which were similar to fibroblasts. When cells almost reached the confluence, the cells showed slabstone-like appearance. Trypan blue staining showed that, the primary cell viability was 99%, and passage 3 cells had 93%-95% viability. The proliferation of nucleus pulposus cells gradually decreased as the generation increased. Compared with passage1 cells, passage 2 and 3 cells at logarithmic phase trended to be smoother. The cell morphology observed under laser confocal microscopy was similar to the results under phase contrast microscope. The improved simple method can successfully acquire a variety of cells from human degenerative intervertebral disc, and these cells show fine biological properties.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, nucleus pulposus cells, improved simple method, intervertebral disc, lumbar intervertebral disc protrusion, cell culture, cell proliferation, morphology, biological property, type Ⅱ collagenase, cell growth curve, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

王海，黄博，周跃，王建，李长青. 改良简易法获取人退变椎间盘髓核细胞及生物学特点[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(28): 5139-5144.

Wang Hai, Huang Bo, Zhou Yue, Wang Jian, Li Chang-qing. Biological characteristics of nucleus pulposus cells from human degenerative intervertebral disc using the improved simple method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(28): 5139-5144.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

设计：多样本单一方法观察实验。
时间及地点：实验于2011年6月至2012年6月在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室(新桥医院中心实验室为重庆市重点实验室)完成。
材料：

椎间盘标本标准及来源：退变椎间盘纳入标准为：年龄大于40岁；诊断为腰椎间盘突出症、脊柱滑脱、椎管狭窄症并行椎间盘摘除植骨融合内固定术；术前MRI确诊椎间盘退变；无糖尿病、高血压等慢性病，无肝炎、结核等传染性疾病，无严重免疫性和遗传性疾病。收集退变椎间盘手术标本6例(男2例，女4例)；其中腰椎间盘突出5例(4例L_4/5，1例L₅/S₁)，腰椎滑脱1例(L₅/S₁)，退变椎间盘Thompson分级Ⅱ到Ⅲ级见表1。标本收集前皆获患者知情并同意。

实验方法：

获取人退变椎间盘髓核组织：摘除椎间盘手术操作时，有着丰富经验的医师以尖刀切开纤维环后，髓核钳抓取前3钳的组织另用，靠髓核钳的位置凭经验将以后椎间盘中央的髓核组织切除时予以留下，此时髓核组织呈潮湿的白色棉絮状，装入无菌塑料袋并注入约5 mL含有庆大霉素的生理盐水，结扎线结扎袋口，置入经体积分数70%的乙醇消毒且带有冰块的标本桶。标本桶在无菌操作台无菌镊提出标本袋，无菌剪剪开标本袋，小心在无菌状态下取出髓核标本置于培养皿。

髓核细胞的分离与原代培养：以含有100 U/mL双抗的PBS反复冲洗标本直至无血迹及杂质，在眼科显微镜下修剪去掉残留的纤维环和软骨终板，髓核组织剪成约 1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，将剪碎的标本转移入罗口烧瓶，加入5倍体积含0.2 g/LⅡ型胶原酶的无血清培养基，拧紧盖口并以封口膜封口，室温下置于摇床以 120 r/min摇1 h，再置37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱 2 h，以200目不锈钢滤网过滤，收集虑液1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入约3 mL含血清培养基洗涤细胞2次，收集细胞以体积分数10%胎牛血清培养基制作细胞悬液，种植于25 mL的培养瓶中，在37 ℃、体积分数5%CO₂、95%湿度条件的孵箱中培养，倒置相差显微境下观察生长情况。

锥虫蓝细胞活性检测：取P0、P1和P2代细胞的培养和传代期间取细胞悬液，制成细胞浓度为1×10⁸ L^-1悬液，取上述细胞悬浮液约10 μL，37 ℃静置5 min，于细胞计数板在2 min内显微镜下计数4大格蓝染和未蓝染细胞数量，计算活力。

髓核细胞的培养及形态学观察：原代细胞种入培养瓶后，第3天后首次换液，2 mL PBS轻轻漂洗培养瓶，清除杂质及贴壁差的其他细胞，以后每3 d换液1次，每日倒置相差显微镜下观察髓核细胞形态，细胞达90%融合后，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化传代。

MTT法测细胞生长：选生长良好的P1、P2及P3代细胞，胰酶消化，制成细胞悬液，调整各代细胞浓度相同，以每孔200 μL接种于96孔板进行培养，分别于第1，3，5，7，9，11，13天，每天取5孔细胞，加入20 μL (5 g/L)MTT溶液，卵育4 h，小心吸尽孔内培养液，每孔加150 μL二甲基亚砜，水平摇床振荡10 min，酶联免疫仪在490 nm波长参数上测各孔吸光度值。

激光扫描共聚焦显微镜细胞形态观察：P3代细胞达95%融合时，用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化，离心制悬调整培养基的量使其约为2 mL，加入2 mL CFDA- SE(Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)后，37 ℃条件下孵育20 min，轻轻吹打制悬滴入载玻片，制作细胞爬片，避光孵育1 d细胞长满爬片后，PBS漂洗3遍，加入2滴DAPI液染核3 min，PBS再漂洗2遍，滴入2滴抗荧光碎灭剂，封固上机。

主要观察指标： ①髓核细胞体外形态。②细胞各代间的活性。③体外增殖活性。④胞核和胞质结构和形态。

讨论

自从20世纪80年代美国华裔科学家冯元桢提出组织工程学这一概念后，组织工程的研究得到了飞速发展，组织工程学首要因素-种子细胞成为重要的内容之一，然而自体组织细胞具有免疫、生物适应等方面的优势^[11-13]，再植入人体后可能产生的免疫排斥反应要轻，因此，成为选择的主要来源^[12-15]。椎间盘退变所致腰腿痛是骨科的常见疾病^[16]，目前对椎间盘退变的治疗手段都属对症治疗，不能阻止或逆转椎间盘退变的进程，因此不能从根本上解决椎间盘退变所致腰腿痛问题^[17-18]。椎间盘退变过程，是一个伴随细胞数减少和细胞外基质合成减少的过程^[19]。现今开展的研究中，都面对椎间盘内细胞数量大量减少的病理生理过程，具有良好生物学性能，并具有一定数量的细胞存在才是生物学治疗椎间盘退变的根本机制，任何新兴的治疗手段，如生物学治疗，大都是建立在具有足够数量并且活性良好的细胞的之上^[20]。对基因治疗或生长因子治疗通过刺激退变椎间盘微环境内的应答细胞，可能有效增加细胞数量和细胞外基质的合成，但是当退变椎间盘内的细胞无反应的或者不正常时，直接注入细胞到椎间盘内或者通过体外构建组织工程椎间盘来修复退变的椎间盘可能更为有效，可以用于阻止或者延缓椎间盘的生理结构及生物学功能的治疗，从而才可能成为一种椎间盘退变更有效的治疗手段^[21-24]。椎间盘生物学治疗方法旨在通过恢复或者重建椎间盘应具有的生理结构及生物学功能，但生物学治疗手段中，不管是细胞治疗方法，还是组织工程方法的治疗手段，都需要大量的细胞，现有种子细胞来源有限，探索成熟、可靠的原代细胞获取方法也是一项重要的研究内容^[25]。组织工程学应用中所需的种子细胞，即要有良好的生物学性能，同时又要求安全、有效、可靠，主要特点有：①获取容易，对机体的创伤小，或者无创伤。此外，体外能方便培养、扩增和传代的细胞表型稳定。②较低的免疫源性，致瘤风险低，没有遗传缺陷等潜在的不良反应。③最重要的是在植入体内后能够发挥细胞本身的生物力学性能，并具有良好的组织相容性。能满足这些条件的细胞不失为理想的种子细胞^[26]。目前已成功分离大量来源于椎间盘的干细胞/祖细胞，研究发现这些分离出来的间充质干细胞在生物学性能上类似于骨髓间充质干细胞，具有应用上的优势^[27-30]。此外，随着基础医学的发展，出现了多种细胞治疗手段，近年，基于细胞的治疗方法引起了科研人员的兴趣并显示了其是最具有希望的生物治疗方法之一^[31]。目前已有临床试验证实干细胞的椎间盘植入治疗椎间盘退变性疾病，并证实具有一定的疗效，可能在不久的将来应用于临床治疗实践^[32]。外周成体干细胞在组织标本中的含量极低，筛选干细胞需要大量的细胞基数^[33]。因此，建立快速、可靠的细胞获取途径和方法具有重要的意义。临床中常见的椎间融合术一般都行椎间盘髓核和纤维环及部分软骨终板摘除，这给种子细胞的获取带来了大量标本,这种获取办法不需要额外的手术操作,如骨髓需行穿刺,且正常骨髓来源有限。目前较常应用的原代髓核细胞培养方法，多应用Ⅱ型胶原酶联合胰酶消化法、单纯Ⅱ型胶原酶消化法等。徐远等^[34]在获取大鼠髓核时先以胰蛋白酶酶消化30 min，离心弃上清后再以1 g/L的Ⅱ型胶原酶消化3 h，然后收集进行细胞培养。肖剑等^[35-36]在获取兔椎间盘髓核细胞时，先以2.5 g/L胰蛋白酶消化20 min，边消化边离心，然后再以0.2 g/L的Ⅱ型胶原酶及0.04 g/L脱氧核糖核酸酶Ⅱ中4 ℃消化过夜,锥虫蓝活力检测达到95%-98%，效果较好，但仍然存在操作过程较多，操作失败的概率增加，同时所获细胞并不能保证。胡明等^[37]也采用机械法剪碎后，加入2 g/L的胶原和体积分数10%胎牛血清DMEM/F12培养液消化4 h，每半小时吹打1次，再过滤收集，此方法较为简单，但这些方法皆存在一定的缺限，消化液在较短的时间难以与剪碎的组织充分混匀，获取的细胞数量偏少，仍难以充分利有组织标本，获得的细胞均一性也较差。陶凤华等^[38]也采用改良法将兔髓核组织剪碎后再置入1 g/LⅡ型胶原酶中边消化边吹打15-20 min，然而收集细胞进行原代培养。该方法能可靠地获取髓核细胞，消化阶段时间短，但亦不能充分地利用标本组织。于占革等^[39]在获取兔不同节段椎间盘髓核细胞时，将髓核组织剪碎后先以胰蛋白酶消化30 min，每5 min震荡1次，离心弃上清再加入20 g/L的Ⅱ型胶原酶消化2.5 h，然而收集细胞进行培养。张传志等^[40]直接将兔髓核以2.5 g/LⅡ型胶原酶边消化边吹打20 min，收集细胞用于后期培养。传统胰酶-胶原酶复合消化法不能添加血清或培养基，在数小时的消化过程中易损害消化下来的细胞，所获的细胞后续生物学性能差，不能确保后续实验的顺利进行且可能带来错误的结论^[41]，此外该法操作烦琐，步骤增多增加了污染的机会，失败的概率增大。此外，胰酶的加入也可能导致脂肪等组织的消化而引起杂细胞大量增多。简易法通过去掉胰酶，单独运用胶原酶延长消化时间，克服了传统方法的缺点，但也带来了新的问题，如消化时间延长，获取的细胞数量率下降。实验通过对简易法进行稍微改进，低速摇匀髓核组织使其充分与胶原酶接触充分，动态状态下有利于细胞从髓核组织游出，这样将消化时间缩短至传统方法的水平，而低速摇荡并不影响细胞的活性，获取的细胞数和细胞生长状态没有变化。因此，该方法简单易行，减少了操作工序，减少了实验操作的污染机会，并能达到要求的细胞数量，细胞活力良好，与常见的方法无差异。人体椎间盘髓核细胞一般在3代前状态尚可，4代及4代以后往往生长缓慢，增殖能力下降。细胞经传代培养后，实验所观察的P1、P2和P3代贴壁和伸展能力有所增强，细胞增殖速度无明显下降，因此，第3代以后的细胞生物学性能下降不适合作为种子细胞。实验通过改良简易法获取了高活性的髓核细胞，较传统方法，该方法简单易行、可靠、结果满意，能达到组织工程学对种子细胞的要求，且可以为干细胞的筛选提供大量的细胞基础。

改良简易法获取人退变椎间盘髓核细胞及生物学特点

Biological characteristics of nucleus pulposus cells from human degenerative intervertebral disc using the improved simple method

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